Obtenção e caracterização do mRNA completo do gene PtSRR1 isolado do fungo ectomicorrízico Pisolithus Tinctorius

Abstract

A simbiose ectomicorrízica resulta da expressão de vários genes cujas seqüências e funções devem ser conhecidas para uma melhor exploração desta simbiose. Utilizando microarranjos de cDNA para observar o padrão de transcrição fúngica nos estágios inicias da colonização, identificou-se o gene PtSRR1, cuja porção 3 foi parcialmente seqüenciada e caracterizada. Esta EST de função desconhecida é similar a uma seqüência do fungo Pisolithus microcarpus, obtida aos 21 dias de interação com Eucalyptus e depositada no GenBank. O peptídeo putativo traduzido (75 Aa) corresponde a uma molécula de origem fúngica sobrexpressa em baixa disponibilidade de nitrogênio. Este trabalho teve como objetivos a obtenção da ORF mais provável do gene PtSRR1, através da técnica RACE 5 e a caracterização in silico da proteína codificada por este gene. Para tal, discos de meio cobertos de micélio de P. tinctorius foram repicados em meio MNM líquido e após obtenção da biomassa o RNA total foi extraído e submetido à RACE 5 . O maior fragmento (~400 pb) foi selecionado, purificado e clonado. Os produtos de PCR dos clones foram seqüenciados utilizando-se iniciadores específicos para as regiões que flanqueiam o sítio de clonagem. A seqüência consenso obtida pela junção da nova seqüência (porção 5 ) com a previamente conhecida (porção 3 ) gerou um novo fragmento de 636 pb. O peptídeo traduzido da ORF mais viável (127 Aa) foi analisado através de ferramentas de bioinformática. A análise estrutural preliminar revelou quatro locais potenciais de alterações póstraducionais: dois sítios de N-glicosilação e dois sítios de fosforilação, aliados a uma forte probabilidade de que a proteína PtSRR1 seja transmembranar, composta por uma alfa-hélice hidrofóbica e uma região predominantemente hidrofílica com seis fitas-beta intercaladas por loops. Dado que o peptídeo não possui domínios conservados clássicos de proteínas previamente caracterizadas e que não há estrutura cristalizada similar depositada em bancos de dados, não foi possível prever a estrutura tridimensional da PtSRR1. Os resultados apontam para a necessidade de estudos adicionais sobre o gene da PtSRR1 como um possível controlador/marcador de desenvolvimento fúngico durante os estágios iniciais da interação ectomicorrízica