Expressão do gene L1 de HPV-16 em Pichia pastoris empregando promotor induzível Paox1 e promotor constitutivo Ppgk1 visando desenvolvimento de um sistema para produção vacinal

Abstract

A infecção persistente por tipos oncogênicos de Papilomavírus Humano (HPV) é necessária para o desenvolvimento do câncer cervical e para uma grande porcentagem de outros tumores anogenitais e orofaríngeos. Desde que essas doenças têm como agente etiológico um vírus, a vacinação profilática representa uma intervenção barata, efetiva e logisticamente simples. A proteína L1 do capsídeo viral é capaz de arranjar-se em partículas morfologicamente e antigenicamente semelhantes ao vírus denominadas Virus-like particles (VLPs), abordagem esta utilizada pelas vacinas anti-HPV atualmente licenciadas. Apesar da eficácia comprovada, a implementação dessas vacinas é um desafio devido à desconhecida duração da proteção por elas conferida, o elevado custo atrelado e a possibilidade de outros tipos virais carcinogênicos emergirem. O sistema de expressão baseado em Pichia pastoris tem sido explorado para produção de VLPs de HPV, mas os níveis de expressão relatados têm sucesso variado e todos os trabalhos empregam vetores comerciais baseados no promotor induzível do gene AOX1 (PAOX1). No presente trabalho, avaliamos a produção extracelular da proteína L1 de HPV-16 em P. pastoris, mediante utilização dos sistemas baseados no promotor PAOX1 e no promotor constitutivo do gene PGK1 (PPGK1). Linhagens de P. pastoris recombinantes foram geradas mediante eletroporação com os cassetes de expressão pPICZAα-L1H16 e pPGK 3-L1H16. Clones contendo múltiplas cópias de cada cassete foram selecionados por ensaios de resistência à ZeocinaTM e triados quantos aos níveis de expressão mediante Colony blotting e Dot blotting, utilizando anticorpo anti-L1 (CamVir®). Embora tenha se observado aparente degradação e glicosilação da proteína L1, os resultados obtidos por Western blotting a partir das induções em frasco revelaram que o sistema baseado no promotor PPGK1 apresentou maiores níveis de expressão do que àquele baseado no promotor PAOX1. A tentativa de purificação da proteína L1 com resina de afinidade se mostrou insatisfatória, possivelmente devido à problemas conformacionais na cauda de poli-histidina. Esses resultados representam análises preliminares passíveis de otimização. Os eventos de glicosilação precisam ser confirmados por análises mais detalhadas. Metodologias alternativas para purificação das VLPs estão sendo avaliadas, bem como estratégias de cultivo para minimizar a proteólise de L1. O presente trabalho demonstra que o sistema não comercial baseado no promotor constitutivo do gene PGK1 de P. pastoris representa uma atrativa plataforma para produção de VLPs de HPV com fins vacinais.