Produção, caracterização e purificação de colagenases a partir de cepas de Streptomyces spp. da Região Amazônica

Abstract

Colagenases são enzimas proteolíticas de grande interesse industrial. O custo desta enzima purificada é muito elevado, gerando a necessidade da busca de métodos alternativos de produção. O trabalho objetivou selecionar uma cepa do gênero Streptomyces produtora de colagenase extracelular, determinar as melhores condições de cultivo para a produção da enzima pela cepa selecionada, realizar a caracterização bioquímica parcial das colagenases produzidas e a purificação parcial das colagenases através do sistema de duas fases aquosa (SDFA) PEG/fosfato. As cepas foram submetidas ao cultivo líquido sob condições controladas, analisando a capacidade de degradar gelatina e azocol, para a escolha do melhor produtor de colagenase. Em seguida foi realizado um planejamento experimental completo 24 para a seleção das melhores condições de produção, onde pH, temperatura, velocidade de agitação orbital e concentração do substrato foram estudados. Foi realizada a seguir a caracterização bioquímica da enzima e a purificação parcial das colagenases através do SDFA PEG/fosfato. Dois planejamentos experimentais completos (24 e 22) foram usados para escolher as variáveis significativas para o processo de extração, sendo o pH, a massa molar do PEG, concentração de PEG e concentração de fosfato as variáveis independentes investigadas. O primeiro SDFA foi composto por, PEG com massa molar de 1500, 4000 e 8000 g / mol com concentrações de 12,5, 15,0 e 17,5% (w / w), fosfato de concentrações de 10,0, 12,5 e 15,0% (w / w) e pH (6,0, 7,0 e 8,0). O segundo planejamento foi composto por, PEG com massa molar de 4000, 8000 e 10.000 g / mol com concentrações de 12,5% (w / w), fosfato de concentrações de 10,0% (w / w) e pH (6,0, 7,0 e 8,0). As respostas avaliadas foram: fator de purificação, coeficiente de partição e rendimento em atividade da enzima. Dentre as cepas de Streptomyces estudadas, mais de 97% foram capazes de degradar a gelatina e de utilizar o azocol como substrato, porém, o Streptomyces sp. DPUA1559 foi considerado o melhor produtor da colagenase. A máxima produção da enzima foi obtida após 72 h de fermentação, com atividade colagenolítica de 21,13 U/ml. Através do estudo de produção utilizando planejamento fatorial foi possível obter um valor da atividade colagenolítica de 39,13 U/ml e definir as melhores condições de cultivo (100 rpm, pH 6,0 e 1,5% de gelatina a 28°C). A colagenase apresentou pH ótimo 8,0 e estabilidade na faixa de pH 7,4 a 9,5 durante 5h. Foram observados dois picos de temperatura ótima que foram em 37°C e 50°C, indicando a presença de mais de uma enzima as quais foram estáveis na faixa de 25 a 70°C durante 5h. As colagenases encontradas foram identificadas como serino e aspártico proteases. O zimograma demonstrou várias bandas com atividade proteolítica: 108, 64, 57, 48, 45 e 43kDa. Os melhores resultados obtidos a partir do SDFA foram (coeficiente de partição 0,36, o rendimento de atividade de 167,2% e fator de purificação de 2,53) foram obtidos com o sistema PEG 8000, pH 8,0, c oncentração de PEG 12,5% (m / m) e concentração de fosfato de 10,0% (m / m ). Os resultados demonstram o potencial do uso de Streptomyces sp. DPUA1559 como produtores de colagenases e que o SDFA foi seletivo para extração de colagenases.