Produção de proteínas utilizando leveduras como sistema de expressão

Abstract

Leveduras vêm sendo utilizadas como sistemas de expressão para produção de proteínas de interesse biotecnológico. Dentre as diversas aplicações das proteínas heterólogas, as produzidas com finalidade terapêutica e para diagnóstico clínico vêm recebendo grande destaque, como por exemplo, a lectina frutalina e a oncoproteína E7 do Papilomavírus Humano (HPV). A frutalina, lectina extraída das sementes da fruta-pão, tem sido descrita como importante ferramenta no diagnóstico do câncer devido ao seu tropismo com células tumorais. Enquanto, a oncoproteína viral do HPV, E7, por ser encontrada em células tumorais relacionadas à infecção pelo HPV, torna-se um importante alvo para o desenvolvimento de vacinas profiláticas e terapêuticas contra esta infecção. Neste trabalho utilizamos as leveduras Pichia pastoris KM71H e Pichia pastoris GS115 como sistemas de expressão para a produção das proteínas frutalina e E7 do HPV16, respectivamente. A influência da fonte de carbono e do estresse iônico na produção da enzima β-galactosidase pela Kluyveromyces lactis DSM 3795 foi avaliada em diferentes condições de cultivo. Neste trabalho os níveis de frutalina recombinante (13,4 mg.L-1), obtidos pelo processo de batelada alimentada, foi 4 vezes maior que em testes com frascos aerados e a suplementação com elementos traços permitiu o aumento de 2.5 vezes na produção da proteína recombinante. Enquanto, o gene de E7 do HPV16 foi corretamente clonado e integrado ao genoma da P.pastoris GS115, sendo produzido 218,9mg.L-1 da proteína E7 com o peso molecular de 27KDa. A avaliação da influência da fonte de carbono e do estresse iônico na atividade da enzima β-galactosidase pela K. lactis DSM 3795 permitiu selecionar a lactose como a fonte de carbono ideal, pois favoreceu maior atividade específica da enzima (271,0 U.mg-1). Enquanto que, os cátions Na+, K+, Mg2+ potencializaram a atividade da enzima (410,4; 440,1; and 734.71 U.mg-1, respectivamente), o Ca2+ inibiu parcialmente a produção da β-galactosidase. Por fim, apesar da P. pastoris ter se mostrado um sistema eficiente para a produção de proteína heterólogas, ela ainda apresenta algumas limitações. Dessa maneira, o desenvolver estratégias que permitam a otimização de vetores para a produção dessas proteínas, representa um importante alvo no desenvolvimento de produtos para o diagnóstico, prevenção e tratamento do câncer