Extração líquido-líquido da lectina da entrecasca de Crataeva tapia L. utilizando micelas invertidas

Abstract

As lectinas são proteínas ubíquas na natureza que se ligam reversívelmente a mono, oligo, polissacarídeos e glicoconjugados. Não apresentam atividade catalítica e ao contrário dos anticorpos, não são produtos de uma resposta imunológica. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a extração e a reextração de uma lectina purificada por cromatografia de troca iônica (CrataBL) e do extrato bruto (EB) da entrecasca de Crataeva tapia utilizando o sistema de micelas invertidas, constituídas pelo surfactante dioctilsulfosuccinato de sódio (AOT) em isooctano. A entrecasca de Crataeva tapia foi coletada na região da cidade do Recife (Pernambuco, Brasil) e o extrato [10 % (p/v) em 150 mM NaCl] foi obtido por trituração e agitação durante 16 h a 4 oC, filtrado em gaze e centrifugado (4.000 x g durante 15 min). O sobrenadante obtido foi denominado de extrato bruto (EB). Os fatores que afetam a extração da proteína tais como: tempo de contato de agitação (5 - 20 min), força iônica, incluindo o tipo de sal (NaCl, KCl e CaCl2) e concentração (30 300 mM), pH da fase aquosa (pH 3,0 12,0) e concentração do surfactante (5 - 100 mM AOT), foram investigados. Os parâmetros avaliados para a reextração foram: pH da fase aquosa (pH 5,0 7,0) e força iônica (50 - 1000 mM de KCl) tendo sido adicionado ao sistema 5% Butanol. Os parâmetros velocidade de agitação (900 rpm), temperatura (25oC) e concentração de proteína (0,374 mg/ml), foram mantidos constantes em todos os experimentos. Os melhores resultados para extração foram obtidos com 5 min de tempo de contanto entre as duas fases, 30 mM de NaCl, tampão citrato/fostato pH 5,5 e 5 mM de AOT, onde foi possível obter extrações protéicas de 100 % e 70 % para CrataBL e EB, respectivamente. Para a reextração, as melhores condições foram, tampão citrato/fosfato 10 mM, pH 5,5 acrescido de 1000 mM de KCl, onde foi possível obter uma recuperação protéica de 45,25 % (CrataBL) e 80,65 % (EB) com 50 % da atividade hemaglutinante para ambas as amostras. As amostras obtidas com as melhores condições de extração e reextração aplicadas ao EB revelaram apenas uma banda na PAGE para proteínas básicas e duas bandas no SDSPAGE. A cromatografia de gel filtração (AKTA) indicou dois picos: um de 40 KDa e outro de 29 KDa. A natureza oligomérica da lectina foi detectada por cromatografia de filtração em gel e SDS-PAGE. A comparação dos perfis cromatográficos de filtração em gel do EB com o da lectina purificada, indicaram a eficiência do sistema de micelas invertidas na purificação da lectina