Uma Lectina do líquen Cladonia verticillaris : purificação e caracterização parcial

Abstract

Lectinas são proteínas ou glicoproteínas de origem não imunológica que possuem sítios de ligação para carboidratos e/ou glicoconjugados. Uma lectina do líquen Cladonia verticillaris foi purificada através de cromatografia de exclusão molecular. O líquen triturado foi submetido à extração e uma purificação parcial por fracionamentos utilizando sulfato de amônio. As amostras foram submetidas a ensaios de atividade hemaglutinante (AH) e suas concentrações protéicas foram estimadas. A fração mais ativa, F1 (0-30 %), foi submetida a ensaios de inibição, a ensaios de estabilidade térmica e de dependência de íons divalentes, assim como a ensaios cromatográficos para a purificação e caracterização lectínica. ClaveLL foi isolada através de cromatografia de exclusão molecular de F1, e submetida aos mesmos ensaios; foi também avaliada quanto à estabilidade da AH em valores de pH compreendidos de 2 a 12. F1 e ClaveLL foram analisadas em eletroforeses em gel de poliacrilamida (PAGE) para proteínas nativas ácidas e básicas, assim como para proteínas desnaturadas. F1 foi inibida parcialmente por carboidratos (N-acetil-D-glicosamina, xilose, arabinose, ramnose e manose) e glicoproteínas (fetuína, caseína, ovalbumina e peroxidase) ou totalmente (glicoproteínas presentes em soro fetal bovino e em soro de coelho). ClaveLL foi inibida parcialmente por carboidratos (N-acetil-D-glicosamina, galactose, ramnose, manose, glicose e trealose) e ovalbumina, e inibida totalmente por fetuína, asialo-fetuína, caseína, asocaseína e glicoproteínas presentes em colostro, soro de coelho e soro fetal bovino. F1 foi termoestável, mantendo sua AH a 80°C, enquanto ClaveLL foi sensível ao aumento de temperatura. F1 e ClaveLL não foram dependentes de íons, mas MnCl2, BaCl2, CaCl2 e MgCl2 estimularam sua AH. ClaveLL foi mais ativa nos valores de pH ácido (5,5) ou básico (11,0). PAGE contendo SDS resolveu F1 e ClaveLL como única banda polipeptídica (glicosilada) com peso molecular menor que 14 kDa. F1 glicosilada pode ter resíduos glicose/manose uma vez que se ligou à Cramoll 1,4-Sepharose, uma matriz de afinidade com a lectina de semente de Cratylia mollis, isoformas 1 e 4 glicose/manose específica, imobilizada à Sepharose CL-4B. PAGE para proteínas nativas ácidas detectou em ClaveLL uma única banda que migrou junto com a frente de corrida; o mesmo foi observado em PAGE para proteínas nativas básicas. Cromatografia de ClaveLL através de filtração em gel em sistema ÄKTA-FPLC, resolveu três picos distintos com AH, que sugeriram formas de agregados moleculares para a lectina nativa, com pesos moleculares estimados em 170, 110 (pico principal) e 82 kDa. Concluindo, ClaveLL glicosilada altamente purificada é estável a pH e principalmente inibida por glicoproteínas