Deleção do gene PGI1 da levedura Pichia stiptis para aumentar o rendimento fermentativo a etanol.

Abstract

Nos últimos 15 anos, um grande esforço tem sido feito para uma maior utilização de resíduos agroindustriais renováveis, podendo a biomassa lignocélulosica ser matéria prima para os bicombustíveis. A composição dessas biomassas varia bastante, mas em geral os substratos lignocelulósicos são constituídos de celulose (homopolímero de glicose), hemicelulose (heteropolímero de hexoses e pentoses) e pela lignina (compostos aromáticos). Considerando que a fermentação de glicose pode ser realizado de forma eficiente, a bioconversão da fração das pentoses (xilose, principal açúcar pentose obtido na hidrólise da hemicelulose), apresenta um desafio. A levedura Pichia stipitis pode converter xilose a etanol com rendimentos industrialmente relevantes. Porém necessita de condições limitantes de oxigênio, além do consumo da glicose inibir de modo não competitivo a xilose e sob condições de crescimento similares o consumo de glicose é maior que o de xilose. Com base na análise da via metabolica desta levedura, o presente trabalho teve como objetivo redirecionar o fluxo metabólico da via glicolitica para via das pentose fosfato dentro do que se chama modernamente de Engeharia Metabólica. O gene PGI1 codificador da fosfoglicose isomerase foi completamente removido do genoma da linhagem nativa NRRL 7124 com o uso de fragmentos de PCR que continham seqüências com mais de 350 bp de homologia com as regiões 5 e 3´ do gene alvo. Quando este gene foi deletado, a glicose-6-fosfato foi inteiramente rotada para via da pentose fosfato. Este fluxo direciona a produção de NADPH fundamental para a produção de precursores de nucleotídeos, aminoácidos, em reações biossinteticas redutivas e também na conversão de xilose a xilitol. Para seleção do transformante, foi necessária uma concentração de 1200μg/ml de Geneticina. Além disso, a eficiência de transformação foi baixa, em parte devido à utilização do sistema não convencional de códons por esta levedura. O cassete de deleção construído apresenta a marca de seleção resistente a geneticina ladeado por duas regiões denominadas loxp, que permitem a recombinação por sistemas de contra-seleção. Possibilitando a remoção da marca de resistência