Análise da dieta de morcegos insetívoros em ambientes cavernícolas através de metabarcoding de eDNA

Abstract

Os morcegos insetívoros são indicados como principais consumidores noturnos de insetos, incluindo espécies consideradas pragas agrícolas e vetores de doenças para humanos. A maioria das identificações dos artrópodes consumidos é realizada através da observação direta das fezes e/ou do conteúdo estomacal dos morcegos, dificultando a identificação específica das presas. Recentemente, para facilitar esta identificação, desenvolveram-se técnicas moleculares não invasivas como metabarcoding atrelado ao sequenciamento de alto rendimento. Mediante este processo é possível realizar o sequenciamento simultâneo de diferentes DNAs extraídos de amostras de materiais conglomerados, como o guano dos morcegos. Estudos que utilizam DNA ambiental precisam da padronização dos procedimentos moleculares e os protocolos devem ser testados em quaisquer estudos iniciais. Amostras provenientes de cavernas na Caatinga, em Pernambuco, na Mata Atlântica, em Sergipe, e na Floresta Amazônica, no Pará, foram armazenadas em etanol 96%, em solução de estabilização RNA Later ou in natura e posteriormente congeladas em ultra freezer -80ºC. Portanto, neste estudo foram testados esses três métodos de estocagem de guano, dois kits de extração de DNA e a padronização da amplificação, incluindo a escolha dos iniciadores para o gene mitocondrial Citocromo C Oxidase I. Para isso, foram selecionados três conjuntos de iniciadores diferenciando-se pelo tamanho adequado a tecnologia de sequenciamento de nova geração Illumina: UEA2/UEA3 (130 pb) sequenciado no MiniSeq (paired-end 300 ciclos), UEA3/UEA4 (370 pb) e UEA5/UEA6 (350 pb), ambos sequenciados no MiSeq (paired-end 600 ciclos). As sequências geradas foram agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs). A coleta de guano em todas as cavidades resultou num total de 397 amostras. Deste total, 250 amostras foram selecionadas para a extração do DNA. Para os testes de estocagem, extração e amplificação do DNA foram selecionadas doze amostras. O método de armazenamento mais eficaz foi in natura, seguido daquele com adição de buffer e por último a adição de etanol 96%. Para os testes de amplificação com os três conjuntos de iniciadores foram selecionadas 13 amostras. Após os testes com os iniciadores, o fragmento de 130 pb foi selecionado para o sequenciamento de 29 amostras. Neste sequenciamento foram geradas 13.636 OTUs. Destas, 1.117 OTUs (8,2%) possuem similaridade igual ou acima de 97% com o banco de dados de nucleotídeos do NCBI e 408 OTUs (2,98%) são representativas para táxons de artrópodes com similaridade igual/acima de 97%. Lepidoptera e Diptera foram as ordens mais frequentes nas amostras, incluindo espécies pragas agrícolas e vetores de doenças. A diversidade dos itens alimentares encontradas na dieta dos morcegos insetívoros reforça a capacidade desses animais na prestação dos serviços ecossistêmicos, principalmente quando suprimem artrópodes que podem causar prejuízos à agricultura e outros que podem ser transmissores de doenças.