Efeito da preservação pelo método de liofilização sobre a estabilidade fenotípica de Aspergillus niger e Aspergillus oryzae

Abstract

Os fungos possuem grande importância tanto para o meio ambiente quanto para a humanidade, necessitando assim de serem preservados, garantindo sua disponibilidade para utilizações futuras e manutenção da biodiversidade. Dentre os fungos, o gênero Aspergillus se destaca por possuir grande potencial biotecnológico, e dentre as técnicas de preservação mais utilizadas, se destaca a liofilização por ser um método a longo prazo mais utilizado na preservação de fungos objetivando manter a viabilidade e estabilidade genética das cepas liofilizadas. Contudo, são poucos os estudos que avaliam a capacidade deste método em preservar tais características. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi determinar o efeito da liofilização sobre a estabilidade fenotípica de Aspergillus niger (URM 5162) e Aspergillus oryzae (URM 5638), em função do tempo e do uso de meios de cultura diferentes, através de análises proteômicas por SDS-PAGE. As cepas, obtidas da Coleção de Culturas Micoteca URM, foram repicadas em placas de Petri contendo meio Ágar Extrato de Malte a 25 °C por 5 dias, liofilizadas e submetidas a dois tratamentos: controle (mantidos a 4 ºC) e estresse (submetidos ao armazenamento acelerado a 40 °C por 15 dias), utilizando seis réplicas para cada tratamento. Após este período, as cepas foram reativadas e submetidas às mesmas condições de cultivo anterior. Posteriormente, três fragmentos circulares de 5 mm desse material inoculados em 100 mL dos meios líquidos: extrato de malte e extrato de malte 2% Tween 80. Os inóculos foram mantidos sob agitação a 120 rpm e 25 °C e coletadas nos períodos de 24, 48 e 72 horas. As culturas foram filtradas para separar o secretoma do proteoma e ambos foram armazenados para posterior análise. A extração das proteínas totais solúveis intra e extracelulares foi realizada utilizando Metanol/TCA/Fenol e quantificada pelo método de Bradford. Foi confirmada a eficiência do processo de extração e identificação preliminar de bandas diferenciais entre os tratamentos. Os resultados da análise SDS-PAGE indicaram a maior eficiência na extração e detecção de proteínas no tratamento realizado com A. oryzae, em meio contendo Tween 80 e no tempo de 48 horas. Tais parâmetros foram utilizados para análise 2D seguido de espectrometria de massas MALDI-ToF-ToF. De acordo com os resultados obtidos, pôde-se observar diferenças em ambas as análises (1 e 2D), indicando assim que houve alteração fenotípicas resultantes do acúmulo de proteínas diferenciais. Foram identificadas proteínas envolvidas em diversos processos biológicos especialmente regulação biológica, processo celular e processo metabólico. Contudo, apenas estes resultados não são suficientes para se definir se a liofilização é ou não eficiente na manutenção das características fenotípicas, sendo necessário a identificação das proteínas do gel 2D ou análise enzimática.