Identificação e purificação das proteínas plasmáticas mediante o emprego de compósitos magnéticos com heparina

Abstract

Heparina é um glicosaminoglicano de elevada carga negativa que pode ser utilizado como ligante de afinidade ou trocador iônico para purificação, identificação e depleção de proteínas. Por apresentar grupos funcionais reativos, a heparina, se torna bastante atrativa para os estudos em imobilização de biomoléculas. No presente estudo, foram sintetizadas e caracterizadas três diferentes partículas magnéticas: Dacron(polietilenotereftalato)-hidrazida magnético (mDAC), quitosana magnética (QS-MAG) e magnetita revestida com polianilina (MAG-PANI). Essas partículas foram magnetizadas a partir do método da co-precipitação de cloreto férrico e ferroso em meio aquoso e alcalino. Esses materiais serviram como suporte para imobilização covalente da heparina mediante a formação de uma ligação amida entre os grupamentos amina presentes nas partículas magnéticas com os grupos carboxílicos da heparina funcionalizados com carbodiimida (EDAC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). A morfologia e distribuição das partículas foram analisadas por microscopia eletrônica (varredura e transmissão) e indicaram que mDAC, QS-MAG e MAG-PANI apresentaram um tamanho de 1-2 μm, 100-300 μm e 12 nm, respectivamente. Foram realizadas análises por difração de raio-X para evidenciar a presença da magnetita (Fe3O4) e dos polímeros (polietilenotereftalato, quitosana de baixo peso molecular e polianilina) nas diferentes partículas sintetizadas. Para finalizar a caracterização física dos materiais, medidas de magnetização foram realizadas, e todas as partículas sintetizadas demonstraram um comportamento superparamagnético. A saturação magnética (Ms) para mDAC, QS-MAG e MAG-PANI heparina foram 23, 15 e 68 emu/g, respectivamente, nas temperaturas de 293 K, 300 K e 313 K. A quantidade de heparina imobilizada em mDAC, QS-MAG e MAG-PANI foi, respectivamente, 51 ± 0,1; 93,8 ± 1,93 e 43 ± 6,2 μg de heparina por mg de cada suporte. Na etapa de purificação/separação das proteínas plasmáticas, diferentes volumes de plasma humano total e diluído foram incubados com as partículas de mDAC e QS-MAG com heparina imobilizada covalentemente. A eluição das proteínas foi realizada com concentrações crescentes de NaCl entre 0,15 e 2,0 M em tampão fosfato 10 mM pH 7,4 ou tampão fosfato 10 mM pH 5,5 ou tampão Tris-HCL 50 mM pH 8,5. As nanopartículas de MAG-PANI com heparina imobilizada covalentemente foram utilizadas para avaliar a interação/afinidade com enzimas plasmáticas humanas específicas: trombina e Fator Xa. As proteínas que foram eluídas após incubação do plasma humano com a heparina imobilizada nas partículas magnéticas foram investigadas por eletroforese SDS/PAGE e/ou separadas por gel-filtração (Superdex G75 - AKTA Purifier) e/ou sequenciadas por LC/MS. Ensaios de atividade biológica das proteínas purificadas foram analisadas pelo TP, TTPa e teste de inibição da trombina (cromogênico) e revelaram a presença de inibidores da família das serpinas, como por exemplo a antitrombina, que foram separados/purificados. Além disso, proteínas como albumina humana, protrombina, trombina e Fator Xa apresentaram afinidade à heparina imobilizada nas partículas magnéticas, o que garante a utilização dessa ferramenta como uma alternativa fácil e de baixo custo para a purificação e identificação dessas proteínas.