Avaliação de lipossomas sítio-específicos contendo ácido úsnico frente a macrófagos infectados com Mycobacterium tuberculosis

Abstract

O objetivo desse estudo foi avaliar a atividade do ácido úsnico (AU) encapsulado em lipossomas revestidos com fucana (AU-LipoFuc) em macrófagos J774 infectados com Mycobacterium tuberculosis (Mtb). A fucana (Fuc) foi extraída a partir da F. vesiculosus, e posteriormente realizada sua conjugação ao colesterol e caracterizada através da espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), calorimetria de varredura diferencial (DSC) e por espectroscopia de raios X por dispersão em energia (EDX). Os lipossomas sem fucana (Lipo), contendo 5 mg de Fuc-hidrofobizada (Lipo-Fuc5) e 10 mg de Fuc-hidrofobizada (Lipo-Fuc10) encapsulando AU (80 mM) foram preparados pelo método de hidratação do filme lipídico e caracterizados através de tamanho médio das vesículas (TP), índice de polidispersão (PDI), potencial zeta (ζ) e eficiência de encapsulação do AU nos lipossomas (EE%). A captura dos lipossomas pelos macrófagos foi avaliada a partir do cultivo das células em placas de 24 poços, onde as formulações foram adicionados e a placa incubada por 1h e 3h. Para avaliar a endocitose, inibidores das vias foram utilizados antes da adição das formulações, sendo posteriormente incubadas por 1h. A ação antimicobacteriana de AU-LipoFuc5 foi avaliada utilizando macrófagos infectados com o Mtb (H37Ra) onde, após 3 horas de infecção, as células foram tratadas com AU e fármacos padrões durante 24 h. Após o tratamento, as células foram lisadas, a bactéria extraída, e plaqueadas. Após crescimento das UFC, estas foram contadas e o resultado expresso: + (0 a 5 UFC); ++ (6 a 10 UFC); +++ (11 a 15 UFC); ++++ (16 a 20 UFC) e +++++ (> 20 UFC). O FTIR revelou absorção da Fuc, Fuc-Hidrof, e do radical de colesterol conforme a literatura. Para o DSC, a fucana livre e a fucana hidrofobizada apresentaram 3 estágios (desidratação, pirólise e desvolatilização). O EDX confirmou a presença de enxofre na Fuc (20,94%) e na Fuc-Hidrof (22,18%). Lipo-Fuc5 e Lipo-Fuc10 apresentaram aumento de tamanho significativo de 241,2 ± 41,08 nm para 2050,3 ± 9,1 nm, respectivamente, quando comparadas aos lipossomas sem revestimento (Lipo = 104,8 ± 0,9 nm). O aumento no tamanho das vesículas também foi observado em lipossomas contendo AU (AU-Lipo-Fuc5= 1441,6 ± 3 nm; LipoFuc10= 2243,6 ± 5 nm), os quais apresentaram EE% em torno de 97%. Todas as formulações apresentaram PDI abaixo de 1, e houve uma diminuição do ζ com o aumento da concentração da Fuc, sugerindo sua presença na superfície dos lipossomas. Fluorescência foi observada em macrófagos incubados com Lipo-Fuc5 e Lipo-Fuc10 nos tempos de 1 h e 3 h, e apenas em 3 h para macrófagos incubados com Lipo. Lipo foi capturado via clatrina e Lipo-Fuc10 pelas vias clatrina e macropinocitose. Lipo-Fuc5 não foi internalizado por nenhuma via analisada neste trabalho. AU encapsulado em lipossomas revestidos com fucana (3,42 µg/ml) apresentaram atividade antimicobacteriana similar à RMP (0 a 5 UFC) e superior àquela do EMB (16 a 20 UFC), mesmo em concentração 4,7 vezes menor em relação ao EMB. A formulação lipossomal revestida com fucana Lipo-Fuc5 permite, portanto, explorar o potencial anti-TB do ácido úsnico.