A enzima 3-hidróxi-quinurenina transaminase de Aedes Aegypti como alvo de 1,2,4-oxadiazóis

Abstract

O mosquito Aedes aegypti é o vetor de arboviroses como a dengue e a febre Zika, doenças que acometem uma grande quantidade de pessoas principalmente em áreas tropicais. O controle químico é a principal estratégia atual para a diminuição populacional do mosquito, apesar de induzir mecanismos de resistência a longo prazo nos insetos. Em muitos casos, os alvos destes inseticidas são vias bioquímicas importantes para o vetor, que uma vez alteradas, encerram o ciclo de vida dos mosquitos. Uma dessas vias em mosquitos é a via das quinureninas, que culmina com a transformação da 3-hidróxi-quinurenina em ácido xanturênico pela enzima 3-hidróxi-quinurenina transaminase (HKT). Trabalhos prévios do nosso grupo mostraram que compostos contendo o núcleo do 1,2,4-oxadiazol apresentam atividade larvicida com evidências de que estas moléculas são prováveis inibidoras da HKT. Para provar esta hipótese, decidimos investigar o potencial da HKT como alvo molecular de derivados 1,2,4- oxadiazólicos. Para este fim, a HKT de Aedes aegypti (AeHKT) foi expressa em Escherichia coli e sua estrutura 3D foi determinada por cristalografia de macromoléculas com difração de raios X. A clonagem, expressão heteróloga e purificação da HKT apresentou um rendimento máximo de 150 mg por litro de cultura. A triagem de mais de 1000 condições de cristalização resultou na coleta de 16 conjuntos de dados provenientes de cristais da HKT de duas linhagens de Aedes aegypti, RecLab (RL_AeHKT) e Rockefeller (R_AeHKT). Problemas com cristais geminados tornaram difíceis o processamento e refinamento do conjunto de dados, mas a determinação da estrutura da RL_AEHKT em resolução máxima de 2,5 Å foi finalizada e está disponível no Banco de Dados de Proteínas. Para avaliar o perfil cinético da HKT e a atividade inibitória dos 1,2,4-oxadiazóis, foi desenvolvida uma metodologia baseada na detecção do complexo ácido xanturênico-Fe3+ em 570 nm, tornando o ensaio mais rápido e de baixo custo. Deste modo, HKT expressa em bactéria exibiu uma constante de Michaelis-Menten de 3,3 mM e eficiência catalítica de 149 min-1.mM-1, sendo estes valores similares aos descritos na literatura. A série de onze sais orgânicos derivados de 1,2,4-oxadiazóis foi testada e seus valores de CI50 variaram entre 42 e 294 μM, se comportando como inibidores não-competitivos. A constante de inibição (KI) do composto canônico desta série foi estimada em 360 μM, valor bem próximo ao KI descrito para o inibidor cocristalizado da HKT de Anopheles gambiae (300 μM). Desta maneira, foi confirmado que os derivados 1,2,4-oxadiazólicos são inibidores da enzima HKT. Esta primeira série de inibidores da AeHKT servirá de modelo para o desenvolvimento de inibidores mais potentes para a HKT. A elucidação do modo de ligação destes compostos está sendo realizada por simulações computacionais visando a identificação de grupos funcionais importantes para o aumento a atividade inibitória em relação à HKT.