Estabelecimento de um modelo in vitro 3D para avaliação do papel das galectinas-1 e -3 na autofagia do microambiente tumoral pancreático

Abstract

O câncer de pâncreas (PDAC) apresenta um perfil de malignidade caracterizado pela resistência terapêutica, decorrente entre outros fatores, de extensas áreas desmoplásicas e hipóxicas. A privação nutricional e a hipóxia são características do microambiente tumoral pancreático que estimulam respostas adaptativas. Estas respostas asseguram a sobrevivência das células neoplásicas, e dentre as mesmas, tem-se o fenômeno autofágico. Dentre as moléculas envolvidas no sucesso do estabelecimento do câncer de pâncreas, destacam-se dois membros da família das galectinas, a galectina-3 (Gal-3) e a galectina-1 (Gal-1). Portanto, o presente estudo teve o objetivo de avaliar a influência das Gal-1 e Gal-3 sobre o fenômeno autofágico do PDAC num modelo mimético do microambiente. Para isto, o crescimento tridimensional das linhagens Mia PaCa-2 e PANC-1 foi caracterizado em diferentes composições de matriz extracelular e dois modelos foram escolhidos. A avaliação da expressão de LC3 em cultivo bidimensional submetido a condições de privação e durações experimentais distintas, foi realizada por western blot. Para escolha do modelo fidedigno de cultivo tridimensional e confirmação da indução autofágica, foi realizada quantificação das organelas autofágicas nas imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão (MET). A caracterização da expressão de LC3 e das galectinas -1 e -3, nas células submetidas a condições de privação nutricional e hipóxia, foi analisada através de imunofluorescência e western blot dos modelos bi e tridimensional. A influência de Gal-3 sobre o processo autofágico foi analisada através de inibição por transfecção com siRNA para Gal-3, no modelo de cultivo bidimensional. Os resultados obtidos mostraram a indução da autofagia nas linhagens PANC-1 e Mia PaCa-2 em modelo de cultivo bidimensional quando mantidas por 24 horas em meios específicos privados de nutrientes. As análises por MET confirmaram a indução da autofagia com maior quantidade mediana de vacúolos autofágicos nos cultivos em starving nutricional para PANC-1 (p = 0,0035) e Mia PaCa-2 (p = 0,0362). A avaliação das expressões proteicas revelou que a expressão de Gal-3 e Gal-1 em PANC-1 aumentaram nas condições de privação nutricional associada à hipóxia, enquanto em Mia PaCa-2, houveram aumentos de Gal-1 porém não de Gal-3. Em ambas as linhagens, as expressões proteicas de LC3 apresentaram o mesmo padrão que o das galectinas. O crescimento dos esferoides a partir do cultivo das linhagens de PDAC apresentou diferentes padrões de acordo com a concentração de colágeno do tipo I na matriz extracelular. E o modelo no qual houve maior quantidade mediana de vacúolos autofágicos foi o composto por matriz com adição de colágeno do tipo I à 2mg/ml para as linhagens PANC-1 (p = 0,0166) e Mia PaCa-2 (p = 0,0002). A análise da expressão proteica neste modelo tridimensional revelou aumento de Gal-1 e Gal-3 na condição de hipóxia isolada para PANC-1 e diminuição de ambas as proteínas na condição simultânea de privação nutricional e hipóxia para Mia PaCa-2. A inibição de Gal-3, por siRNA, no modelo bidimensional, provocou redução da expressão de LC3II e consequentemente do fluxo autofágico em todas as condições experimentais para ambas as linhagens, com exceção da condição simultânea de privação nutricional e hipóxia (H1) para PANC-1. Através dos resultados obtidos é possível concluir que a expressão das galectinas -1 e -3 é modulada pelas condições do microambiente tumoral e o desenvolvimento do tumor é influenciado pela composição da matriz extracelular. Comprovou-se que a expressão das galectinas -1 e -3 e do marcador autofágico LC3 pode apresentar diferentes padrões de acordo com o modelo utilizado no estudo. Ademais, a partir de modelo bidimensional foi provado que a expressão de Gal-3 é importante para o fluxo autofágico do câncer pancreático.