Desenvolvimento de aptassensor eletroquímico para diagnóstico do câncer de mama tipo HER2

Abstract

Cerca de 2.1 milhões de novos casos de câncer de mama (CM), com 630.000 mortes, foram estimadas para 2018 no mundo, sendo 60.000 novos casos com incidência no Brasil. Existem cinco subtipos principais de CM: Luminal A, Luminal B, Fator de Crescimento Epidérmico Humano do receptor-2 (HER2) positivo, triplo negativo não Basaloide e Basaloide. O intervalo ideal entre o diagnóstico e o tratamento deve ser de até 60 dias para melhor prognóstico, entretanto, atualmente no Brasil esse período atinge até 240 dias. O CM é diagnosticado através de rastreio por imagem, como ultrassonografia (USG) e mamografia. Esses meios apresentam algumas limitações. A mamografia tem sua detecção prejudicada em áreas com tecido mamário denso, então, associa-se com a USG para melhor visualização. Identificando uma imagem sugestiva de câncer, faz-se uma biopisa do tecido mamário, seguida de imunohistoquímica (HI) e hibridação in situ de fluorescência (FISH), para estudar o perfil do HER2, uma proteína muito importante para o crescimento, vida e morte programada da celula mámaria. O valor normal do HER2 no soro é de até 15ng/mL. Apesar dos métodos já estabelecidos, HI e FISH, para o diagnóstico, a possibilidade de desenvolvimento de um dispositivo de manuseio simples, rápido e menos invasivo, como os biossensores, será de grande ajuda no diagnóstico precoce do CM. Este trabalho teve como objetivo desenvolver um aptassensor para detectar HER2 em soro humano. Os aptassensores eletroquímicos são biossensores que usam um aptâmero como elemento de biorreconhecimento. Eles analisam por voltametria o sinal resposta para a presença normal ou anormal de um analito em uma amostra biológica. Por sua vez, os aptâmeros são pequenos fragmentos de oligonucleotidios de DNA ou RNA de cadeia simples, produzidos para alvos específicos. O processo de desenvolvimento desse aptasenssor se deu da seguinte forma: um Aptâmero HER2 foi imobilizado por adsorção eletrostática na superfície de um eletrodo impresso em tela, modificado com poli-L-lisina. As medidas foram feitas por voltametria de pulso diferencial (DPV) usando azul de metileno como indicador químico redox da reação. A curva de calibração aprsentou um R2 = 0,9971 utilizando diferentes concentrações de proteína HER2 (10 - 60 ng/mL) diluidas em tampão PBS (pH 7,4), com um limite de detecção de 3,0 ng/mL. Mostrou boa reprodutibilidade, resultando em desvios padrão relativo (RSDs) de 3%. Permaneceu estável por 3 dias, com um RSDs de 2%. Ao realizarmos testes com o soro de uma mulher saudável, foi apresentado um pico de 6,72 μA. E ao testarmos com o soro de uma mulher com câncer de mama HER2 +, obtivemos um sinal de 2,65 μA. Isto denota o mesmo padrão encontrado quando da adição de proteína no soro controle (quando havia uma maior concentração da proteína HER2 foi apresentado um sinal menor). Os testes foram caracterizados por calorimetria de titulação isotérmica (ITC) e mostraram excelente afinidade e interação entre aptâmero e proteína. Os resultados revelaram uma ferramenta promissora e sensível, com potencial no auxílio do diagnóstico molecular do CM.