Potencial biotecnológico de Microgramma vacciniifolia : purificação de proteases do rizoma e avaliação de atividade antimicrobiana de lectina da fronde

Abstract

As proteases são enzimas que catalisam seletivamente a hidrólise de ligações peptídicas e são responsáveis por quase 60% do mercado de enzimas industriais, com aplicação nas indústrias de detergentes, de couro, farmacêutica, biotecnológica e de alimentos. Já as lectinas são proteínas que possuem pelo menos um domínio não catalítico de ligação reversível a carboidratos específicos, apresentando diversas atividades biológicas. Microgramma vacciniifolia (Polypodiaceae) é uma planta epífita que possui propriedades medicinais, por exemplo, no tratamento de infecções respiratórias. Uma lectina (MvFL) foi previamente purificada da fronde e atividade proteolítica foi detectada em extrato do rizoma dessa planta. Este trabalho descreve a obtenção e caracterização de uma preparação de rizoma de M. vaccinifolia contendo proteases a partir do rizoma de M. vaccinifolia, bem como a avaliação do potencial antifúngico e antibiofilme de MvFL contra Candida. Proteínas do rizoma foram extraídas em tampão Tris e atividade proteolítica foi determinada usando azocaseína como substrato. O extrato foi então cromatografado em coluna de DEAE-Sephadex e o pico (P2) de proteínas adsorvidas foi avaliado por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) em condições nativas ou desnaturantes. A atividade proteolítica de P2 foi caracterizada quanto ao pH ótimo e à temperatura ótima, natureza química do sítio catalítico (utilizando inibidores específicos), atividade tripsina-símile e cinética em função do aumento da concentração do substrato. Também foi avaliada a atividade coagulante de leite de P2. Extrato e P2 apresentaram atividade proteolítica de 60 e 50 U/mg, respectivamente. Nenhuma banda polipeptídica foi detectada em P2 por PAGE para proteínas básicas, porém duas bandas foram observadas em PAGE para proteínas ácidas, confirmando a presença de duas proteínas. PAGE em condições desnaturantes revelou duas bandas polipeptídicas, de 24,2 e 32,6 kDa. P2 apresentou maior atividade proteolítica em pH 3,0 (104,97 U/mg) e a 80–90 oC. A avaliação do efeito de inibidores revelou a presença de serinoproteases, cisteínoproteases e metaloproteases. P2 apresentou atividade tripsina-símile sendo determinada uma constante de Michaelis (Km) de 2,359 mM de BApNA e velocidade máxima de 0,02413 mmol BApNA/min. P2 não apresentou atividade coagulante de leite. MvFL foi isolada seguindo procedimento previamente estabelecido e apresentou ação fungistática para C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis e C. parapsilosis com valores de concentração mínima inibitória (CMI) de 20, 0,625, 1,25, 40 e 40 μg/mL, respectivamente. Foram investigados então os efeitos de MvFL sobre o potencial de membrana mitocondrial, integridade lisossomal e proliferação de células de C. glabrata usando citometria de fluxo. Por fim, foram avaliados o potencial de sinergismo junto ao fluconazol e a atividade antibiofilme de MvFL contra todos os isolados. MvFL causou despolarização da membrana mitocondrial, rompimento lisossomal e redução da proliferação em C. glabrata, bem como reduziu a proliferação celular. MvFL foi apenas capaz de reduzir levemente a formação de biofilme por C. tropicalis. A combinação fluconazol-MvFL mostrou efeito sinérgico contra C. parapsilosis, aditivo contra C. krusei e C. tropicalis e antagônico contra C. albicans e C. glabrata. Em conclusão, rizoma e fronde de M. vacciniifolia são fontes de proteínas com promissor potencial biotecnológico.