Produção de imunorreagentes ancorados à superfície celular da levedura Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Diante do cenário atual de emergência e reemergência de doenças infecciosas virais, como o surgimento da COVID-19 e a possibilidade de novos surtos de Zika virus (ZIKV), a busca por estratégias capazes de conter a propagação destas infecções torna-se uma prioridade mundial de saúde pública. O sistema de ancoragem de proteínas à superfície celular da levedura Saccharomyces cerevisiae vem sendo apontado como ferramenta promissora para o enfretamento de epidemias emergentes através do desenvolvimento de imunorreagentes baseados em proteínas antigênicas. Este trabalho teve como objetivo o estabelecimento de uma plataforma de obtenção de imunorreagentes baseada na ancoragem de antígenos virais à superfície de S. cerevisiae. Para demonstrar a aplicabilidade deste sistema, foram construídas duas linhagens de S. cerevisiae expressando um epítopo (N4P5-SARS) da proteína nucleocapsídeo do SARS-COV-2 e o ectodomínio (E80-ZIKV) da proteína do envelope do Zika vírus. Para obtenção dos vetores recombinantes, os genes que codificam E80-ZIKV e N4P5-SARS foram clonados no vetor pYD1, confirmados por sequenciamento de DNA e utilizados para transformar células de S. cerevisiae EBY100. As leveduras recombinantes confirmadas por PCR, foram utilizadas para indução da expressão proteica. Para estabelecer uma boa produção das proteínas virais, analisamos a indução da expressão das proteínas quanto a variação da temperatura (20 e 30°C) e do tempo de indução (24, 48 e 72h). Utilizando as leveduras recombinantes como antígenos em ensaios de ELISA (Yeast-ELISA) com anticorpo direcionado à tag 6xHIS presente no N-terminal das proteínas, foi possível determinar que a melhor condição testada foi 20°C por 72 horas, na qual EBY100:E80-ZIKV e EBY100:N4P5-SARS apresentaram sinal de ancoragem de 1,8 e 5,4 vezes maiores em relação ao controle. A ancoragem das proteínas virais também foi confirmada por microscopia de imunofluorescência e citometria de fluxo, apresentando cerca de 1,11 e 15,1% da população analisada positiva. A imunorreatividade da proteína E80-ZIKV foi também avaliada por Yeast-ELISA, citometria e microscopia utilizando um anticorpo anti-envelope, onde foi possível detectar sua reatividade a um anticorpo comercial específico, apesar do baixo nível de expressão. Todos os experimentos realizados para E80-ZIKV confirmam sua baixa eficiência de ancoragem. Hipotetizamos que o tamanho desta proteína (400 aminoácidos) pode estar interferindo na eficiência de ancoragem, em contraste com a alta expressão detectada para N4P5-SARS (45 aminoácidos). Apesar de sua expressão em baixos níveis, a ancoragem de E80-ZIKV em S. cerevisiae pode ser detectada mesmo após 38 dias de estoque a 4°C. Finalmente, demonstramos que as proteínas virais ancoradas na superfície celular de S. cerevisiae podem ser recuperadas num passo único de incubação em reagente redutor, as quais puderam ser utilizadas com sucesso em ensaios de ELISA para detecção da tag 6xHIS. Este método pode gerar uma alternativa rápida e barata para produção de insumos para imunoensaios que se baseiam no uso de proteínas antigênicas purificadas. Juntos, estes achados auxiliam no desenvolvimento de linhagens recombinantes que podem ser utilizadas como imunorreagentes capazes de serem aplicados em estudos para desenvolvimento de estratégias vacinais anti-ZIKV e anti-SARS-CoV-2, e na sua utilização como ferramentas de diagnósticos para rastrear e evitar a propagação destas infecções virais.