Avaliação de métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR), para o diagnóstico de pacientes em tratamento da malária

Abstract

No presente estudo, abordagens moleculares foram utilizadas para o diagnóstico gênero-específico da malária em pacientes submetidos a tratamento, nos municípios de Monte Negro e Campo Novo no Estado de Rondônia. Avaliamos o limite de detecção de DNA através das técnicas de PCR simples, hemi nested PCR (HNPCR) e hemi nested PCR em um único tubo (STHNPCR) em ensaios realizados com diluição seriada de sangue de pacientes infectados com Plasmodium falciparum. Comparamos a sensibilidade dos testes utilizando duas metodologias de extração na preparação das amostras sanguíneas para serem processadas através da PCR: o Chelex e a Saponina. Com o Chelex, a PCR simples mostrou um limite de detecção de 700 parasitos/μl, enquanto que com a Saponina o limite de detecção foi de 70 parasitos/μl. A HNPCR e a STHNPCR apresentaram limites semelhantes de detecção sendo de 7 parasitos/μl através da extração do Chelex e de 0,007 parasitos/μl pela Saponina. Para os experimentos subsequentes, foi selecionada a extração pela Saponina, em vista da obtenção de melhores resultados. As amostras sanguíneas de 30 pacientes em tratamento para malária foram estudadas através da microscopia ótica, PCR simples e HNPCR. De cada paciente foram coletadas duas amostras em ocasiões diferentes. A 1º coleta foi realizada no 4º e 8º dia de tratamento antimalárico, enquanto que a 2º amostra foi coletada 48 horas após. Todos os pacientes deram resultados negativos tanto para microscopia ótica quanto para PCR simples. O percentual de positividade da HNPCR manteve-se em torno de 50% nas duas coletas pós-tratamento, sendo capaz de detectar o DNA do parasito mesmo em pacientes que se tornaram assintomáticos. Não foi demonstrado associação significativa entre a presença de manifestações clínicas e a positividade pela HNPCR. Os resultados desta pesquisa sugerem que abordagens sensíveis como a nested PCR poderão ser úteis no monitoramento da parasitemia e resposta clínica de indivíduos em tratamento específico, nas situações de oligoparasitemia e na intercepção da cadeia de transmissão epidemiológica da doença