Biossensoriamento estocástico via nanoporo proteico individual no desenvolvimento de métodos analíticos para micotoxinas

Abstract

As micotoxinas (MTXs) podem acometer grãos e cereais durante as fases de pré e pós colheita. Essas substâncias são consideradas como metabólitos secundários produzidos por grupos de fungos filamentosos e o acometimento das commodities citadas acima podem desencadear processos tóxicos, quando consumidos por humanos e animais. Órgãos de controle estabelecem diretrizes para a vigilância dos níveis das MTXs mais tóxicas, listando os principais gêneros alimentícios que devem receber essa atenção. O padrão-ouro para determinação e rastreio das MTXs em alimentos se concentram na utilização da cromatografia líquida, acoplada ao detector de fluorescência ou a espectrometria de massas. No entanto, o uso de matrizes complexas e o alto custo operacional que envolvem estas técnicas dificultam o emprego nas rotinas de monitoramento analítico. Devido a necessidade de ampliar as possibilidades de novos dispositivos analíticos para as MTXs, propomos utilizar o nanoporo da alfatoxina no desenvolvimento de um sensor para detecção e quantificação das principais MTXs de interesse agrícola visando uma metodologia alternativa, menos onerosa e mais rápida que as técnicas convencionais. As bicamadas lipídicas planas livres de solvente foram confeccionadas de acordo com a técnica adaptada de Montal & Mueller, utilizando o lipídeo diftanoil fosfatidilcolina. Todos os experimentos foram realizados em condições de fixação de voltagem (±20 a ±200 mV, incrementos de 20 mV), com solução banhante composta por KCl 1 M ou 4 M, Tris 5 mM, pH 7,5 e temperatura de 25 °C. A adição de ocratoxina A, aflatoxina B1 ou fumonisina B1 à solução de KCl no lado TRANS do nanoporo unitário da alfatoxina, resultou em eventos de bloqueio da corrente iônica reversíveis e característicos. Com a análise de parâmetros extraídos da série temporal de cada MTX foi possível calcular a corrente residual (I/I0), os tempos médios de permanência (τoff) e “interbloqueio” (τon). Essas análises evidenciaram os três perfis das MTXs com valores de I/I0: 0.15 ± 0.001; 0.326 ± 0.025; 0.443 ± 0.025 (n=3) e τoff: 0.0311 ± 0.006 ms, 0.059 ± 0.007 ms e 0.0996 ± 0.011 ms (n=3), para ocratoxina, aflatoxina B1 e fumonisina B1, respectivamente. A determinação da corrente residual associada com o τoff permitem, desta forma, identificar e discriminar as MTXs em solução aquosa, conforme estudos prévios. Em análises com as três MTXs adicionadas simultaneamente em solução no lado TRANS, os valores de corrente residual e dos tempos de τoff permaneceram inalterados, identificando na mistura cada MTX e corroborando com a capacidade multianalítica da técnica trabalhada neste estudo. Também evidenciamos que o fato de aumentar a concentração de KCl de 1 M para 4 M, ampliou a sensibilidade do biossensor em até 5 vezes, corroborando com estudos anteriores. Por fim, a técnica apresentou a capacidade de detectar as MTXs na ordem de nanomolar. Portanto, o nanoporo da alfatoxina mostrou ser capaz de detectar as MTXs, podendo se tornar um método analítico alternativo na quantificação e discriminação de MTXs em meio aquoso.