Avaliação dos parâmetros hematológicos e citotóxicos de uma enzima fibrinolítica como possível candidata ao tratamento da trombose

Abstract

A formação de coágulos de fibrina, principal componente proteico dos coágulos sanguíneos está intimamente envolvida no desenvolvimento das doenças cardiovasculares e por isso, a trombose, desempenha um papel importante na patogênese de vários distúrbios cardiovasculares devido ao acúmulo desses coágulos que bloqueiam a passagem do fluxo sanguíneo. Diante disso, o objetivo desse estudo foi realizar a caracterização bioquímica e avaliar in vitro os aspectos da ação fibrinolítica, trombolítica e toxicidade da protease oriunda de Aspergillus tamarii Kita UCP 1279, uma vez que, a intervenção de pesquisas nessa área pode ajudar no desenvolvimento de agentes trombolíticos mais seguros para o uso terapêutico. A protease com atividade fibrinolítica e purificada pelo sistema de duas fases aquosas e particionada para a fase sal foi avaliada quanto a caracterização bioquímica (pH e temperatura ótima e estabilidade, efeito de íons metálicos, inibidores e ação de surfactantes), determinação da atividade amidolítica, SDS-PAGE e zimograma de fibrina. Além disso, foi avaliado a atividade fibrinogenolítica da enzima e sua degradação trombolítica in vitro. Quantos aos testes toxicológicos foram realizados ensaios de citotoxicidade, determinação dos tempos de coagulação, atividade hemolítica e efeito da albumina sérica sobre a atividade enzimática. A protease fibrinolítica purificada foi caracterizada como uma serino protease e demonstrou uma temperatura ótima de 50oC e se manteve estável até 120 minutos. O pH ótimo foi de 7,0 e estável por 36 horas. A atividade enzimática foi potencializada pela adição de Na+ , Zn2+, Mg2+, Mn2+, K+ e inibida na presença dos íons Cu2+ e Fe3+ e pelos surfactantes Triton X-100 e dodecil sulfato de sódio, com uma diminuição de 37,66 e 62,35%, respectivamente. A enzima exibiu ainda uma maior especificidade para o substrato N-succinil-Gly–Gly–Phe-p-nitroanilida, um substrato típico de quimotripsina. A massa molecular da protease foi em torno de 90 kDa, exibindo também atividade sobre o zimograma de fibrina. A protease purificada não degradou o fibrinogênio, entretanto, promoveu uma degradação de 38,81% do trombo in vitro de fibrina após 90 minutos. Não houve nenhuma toxicidade frente as linhagens celulares testadas e na avaliação hematológica houve um discreto prolongamento do TP quando comparado com o grupo controle. Ainda, constatou-se que não houve interferência sobre a ação da trombina ou do fibrinogênio sobre o TT e em relação ao TPPa, observou-se o prolongamento sobre o tempo de coagulação à medida que aumentou a concentração da enzima. Por fim, foi verificado que nenhuma concentração utilizada demonstrou promover a lise das céluas sanguíneas e que a albumina promoveu um aumento da atividade em 31,70% da atividade enzimática. Mediante os resultados obtidos, a pesquisa revelou que o Aspergillus tamarii Kita UCP1279 possui potencial para a produção de enzimas fibrinolíticas, oferecendo uma alternativa promissora para o tratamento da trombose. A caracterização realizada demonstrou a estabilidade da enzima, que apresenta capacidade de degradar fibrina, ausência de toxicidade e sem alterações nos parâmetros hematológicos. No entanto, são necessários estudos adicionais para avaliar seu desempenho em organismos vivos, abrindo perspectivas para sua potencial aplicação como uma nova droga trombolítica.