Purificação e caracterização de uma proteína de semente de soja (Glycine max L. Merr): avaliação in vitro de atividade antiagregante plaquetária e anticoagulante

Abstract

Uma nova proteína de semente de soja (Glycine max), denominada ApcSP (antiplatelet and anticoagulant soybean protein) foi isolada, purificada e caracterizada bioquimicamente. A partir de extratos brutos destas sementes, foi realizado um fracionamento com sulfato de amônio, obtendo-se a fração F0-60%, com posterior submissão à cromatografia de afinidade em coluna de Cramoll 1,4-Sepharose. As proteínas adsorvidas eluídas com NaCl 1,0 M em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0 foram submetidas à cromatografia de fase reversa HPLC. SDS-PAGE na presença de β-mercaptoetanol revelou uma banda polipeptídica de 51 kDa. Coloração com o reagente de Schiff revelou a natureza glicoprotéica de ApcSP. A seqüência do N-terminal obtido pela degradação de Edman foi EGQFGPMIQS (10 resíduos), que apresenta 20% de homologia com a proteína albumina 2S tipo 3. O espectro de dicroísmo circular foi característico de uma proteína predominantemente α-hélice, e este foi utilizado para estimar as contribuições das frações de estruturas secundárias presentes em ApcSP. Desconvolução usando o programa CDPro indicou a presença de 35% de alfa hélice, 17% de folhas-beta, 22 % de volta-beta e 26% de desordenada. O espectro de Fluorescência de ApcSP revelou uma emissão máxima em torno de 339 nm. A proteína da soja foi excitada em 280 nm e 295 nm, e os espectros de emissão foram monitorados na faixa de 290-450 nm e de 305-450 nm. Atividade peroxidásica foi detectada utilizando guaiacol e diaminobenzidina como substratos. Biologicamente, houve uma inibição da agregação plaquetária induzida por colágeno (100% de amplitude e 98% de slope), trombina (79% de amplitude e 77% de slope) e ADP (62% de amplitude e 58% de slope) na concentração de 2 μM de ApcSP em relação ao controle. Foi também avaliado o efeito da proteína de soja purificada nos tempos de coagulação, afetando as vias extrínseca e intrínseca da coagulação. O tempo de tromboplastina parcialmente ativada (TTPa) foi bloqueado na concentração de 3 e 4 μM, apresentando um R (Relação do tempo de coagulação com o tempo controle de coagulação) > 7,5. Estes resultados evidenciam que ApcSP com as atividades antiagregação plaquetária e anticoagulante pode ser de grande importância para a terapia anti-trombótica e anticoagulante