Purificação e caracterização de uma protease digestiva alcalina (tripsina) do peixe amazônico Pirarucu (Arapaima gigas)

Abstract

A protease alcalina extraída do ceco pilórico do pirarucu (Arapaima gigas) foi purificada em quatro etapas: tratamento térmico, precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de gel-filtração em coluna Sephadex® G-75 e cromatografia de afinidade em coluna benzamidina-agarose. Após as etapas de purificação aplicou-se uma amostra da proteina obtida em gel de eletroforese e verificou-se a presença de única banda que apresentou peso molecular aproximado de 28,0 kDa. Desta forma, após purificação, avaliaram-se as propriedades físico-químicas e cinéticas da enzima e o efeito de íons metálicos e de inibidores de proteases na atividade proteolítica da mesma, utilizando-se benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BApNA) como substrato. O pH e a temperatura ótima de reação encontrada foram 9,0 e 65°C, respectivamente. A enzima mostrou-se estável, após 30 min de incubação, em ampla faixa de pH alcalino (pH 6,0 a 11,5). Após 30 minutos de incubação a 60ºC, foi detectada uma perda de 10% da atividade tríptica. Os valores encontrados para os parâmetros cinéticos (Km, Kcat e Kcat/Km) foram: 0,47 ± 0,042 mM, 1,33 s-1 and 2,82 s-1 · mM-1, respectivamente, usando BApNA como substrato. A atividade tríptica mostrou-se sensível a alguns íons metálicos. A atividade tríptica foi inibida, em ordem crescente, pelos íons: Mn2+ > Ca2+ > Li+ > Cd2+ > Cu2+ > Fe2+ > Hg2+ > Zn2+ > Al3+ > Pb2+. Por outro lado, os íons K+, Mg2+ e Ba2+ não promoveram nenhum efeito na atividade da protease. A enzima foi fortemente inibida por inibidores de tripsina. Os ensaios com substrato específico e inibidores de tripsina forneceram evidências de que esta enzima é provavelmente uma tripsina-símile e suas características sugerem um forte potencial para ser utilizada em processos e produtos industriais