Fracionamento de proteínas plasmáticas com emprego de heparina imobilizada em suportes magnéticos

Abstract

Heparina imobilizada em suportes sólidos tem sido utilizada como ligante de afinidade em processos de identificação e purificação de diversas proteínas. No presente estudo, foram sintetizados e caracterizados dois diferentes suportes magnéticos: Dacron (polietilenotereftalato) magnético (mDAC) e magnetita revestida com polianilina (MAG-PANI). Esses materiais foram utilizados como suporte para imobilização covalente de heparina e os compósitos magnéticos obtidos foram usados no fracionamento, depleção e purificação de proteínas do plasma humano. Para produzir o suporte mDAC, o Dacron foi tratado com hidrato de hidrazina, formando Dacron-hidrazida, e, em seguida, foi utilizado para formar um compósito com a magnetita, produzida por co-precipitação de sais de ferro II e III. O suporte MAG-PANI foi obtido a partir do revestimento da magnetita (obtida por coprecipitação) com polianilina através da oxidação da anilina pelo permanganato de potássio. Para imobilizar a heparina aos suportes foi necessária a ativação dos seus grupos carboxílicos com carbodiimida (EDAC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). Análise por microscopia eletrônica mostrou que mDAC possui um tamanho de 1,5 ± 0,5 μm e 14,4 ± 0,9 nm para MAG-PANI. Difratograma de raio-X indicou a presença do Dacron nas partículas de mDAC e da polianilina em MAG-PANI e em ambos a formação do cristal de magnetita. Além disso, medidas de magnetização demonstraram um comportamento superparamagnético para as duas partículas e uma saturação magnética de 23 e 66 emu/g para mDAC e MAG-PANI, respectivamente, nas temperaturas de 293 K, 300 K e 313 K. A quantidade de heparina imobilizada foi de 51 ± 0,1 e 26,4 ± 0,09 μg de heparina por mg de mDAC e MAG-PANI, respectivamente. Plasma humano foi incubado nos compósitos com heparina imobilizada covalentemente (mDAC-HEP e MAG-PANI-HEP) e posteriormente foram lavados com tampão fosfato com concentrações crescentes de NaCl (0,25; 0,5; 1,0 M). Após esse processo, os eluatos obtidos foram submetidos à eletroforese SDS/PAGE de proteínas. Foram observadas muitas proteínas nas primeiras frações que foram depletadas do plasma (albumina, por exemplo) e as frações obtidas com NaCl 1,0 M demonstraram bandas com peso molecular de 58 kDa que correspondem à antitrombina. Além disso, ao realizar a incubação com a provável antitrombina purificada com o plasma normal, o valor do teste de tromboplastina parcial ativado (TTPa) se mostrou prolongado. Isso ocorreu devido à ação anticoagulante da antitrombina que inibiu a formação da trombina e assim o plasma não coagulou. Sendo assim, o método aqui proposto se mostrou útil como ferramenta de depleção de proteínas plasmáticas e purificação da antitrombina humana apresentando as seguintes vantagens: fácil síntese e separação por afinidade magnética.