Estudos in vitro de novos candidatos a fármacos anti-Leishmania

Abstract

A leishmaniose é uma infecção causada por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania. Atualmente não existe vacina disponível para infecções por Leishmania em humanos e os tratamentos convencionais são tóxicos para os pacientes. Por esse motivo, o desenvolvimento de novas drogas leishmanicidas é uma necessidade urgente. No presente trabalho foi avaliada a citotoxicidade, atividade sobre L. amazonensis selvagem in vitro, a produção de óxido nítrico (NO), a secreção das citocinas IL-12, IL-10 e TNF e a indução da morte celular nos parasitas sob a influência de sete novos compostos sintéticos derivados da estrutura das Tiossemicarbazonas (TS01-TS07). Em paralelo, foi realizado o desenvolvimento de linhagens transgênicas de L. amazonensis e L. Infantum expressando constitutivamente a enzima beta-galactosidase para serem utilizadas em testes de atividade leishmanicida. A citotoxicidade das tiossemicarbazonas foi avaliada em macrófagos peritoneais através do método do MTT e o índice de seletividade foi determinado. Foi avaliado o efeito sobre o crescimento e o mecanismo de morte celular induzido pelos compostos sobre formas promastigotas de L. amazonensis, além de sua atividade sobre amastigotas intracelulares. A produção de NO, bem como de citocinas por macrófagos infectados ou não com L. amazonensis tratados ou não com os compostos foi avaliada pelo reagente de Griess e ELISA de captura, respectivamente. Foi realizada a ligação do gene da beta-galactosidase ao vetor para expressão em Leishmania sp. pLEXSY com posterior transfecção e confirmação fenotípica. As leishmanias transgênicas foram submetidas à Anfotericina B para validação de sua utilização em ensaios de atividade leishmanicida. Todos os compostos inibiram o crescimento de formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis selvagem, além de apresentarem baixa citotoxicidade em macrófagos. TS02 na cultura de promastigotas causou morte celular por apoptose e necrose, com efeito similar à Anfotericina B. Os compostos também se mostraram eficazes na modulação de mediadores imunológicos importantes para a doença: NO, TNF, IL-12 e IL-10. Quanto ao desenvolvimento da linhagem transgênica de L. amazonensis e L. infantum, foi confirmada por PCR e ensaio fenotípico a ligação do cassete de expressão contendo o gene da enzima beta-galactosidase ao genoma das leishmanias transfectadas. As linhagens transgênicas mostraram-se prontas para serem utilizadas em ensaios de teste de drogas in vitro, uma vez que promastigotas e amastigotas intracelulares tiveram seu uso validado frente à Anfotericina B. A baixa toxicidade aos macrófagos, a atividade leishmanicida e a presença de citocinas de perfil Th1 apresentadas sugerem a utilização destes compostos, derivados da estrutura da tiossemicarbazona, como agentes promissores para o tratamento da leishmaniose cutânea. Já as linhagens de L. amazonensis e L. infantum expressando a beta-galactosidase estão aptas para serem utilizadas na rotina laboratorial de avaliação de compostos com potencial atividade leishmanicida.