Avaliação de ferramentas moleculares para detecção de fungos patogênicos relevantes para a saúde humana

Abstract

Infecções fúngicas tem aumentado sua incidência, principalmente em imunocomprometidos. No Brasil, os fungos são responsáveis por cerca de 10% das infecções hospitalares, sendo as espécies de Candida responsáveis por cerca de 50% dos casos, seguidas pelo Aspergillus e Cryptococcus neoformans. O diagnóstico fúngico é dado pelo exame direto, que possui reduzida sensibilidade, e cultura que é tecnicamente laboriosa e demorada. A detecção do genoma de fungos apresenta diversas vantagens como a instalação precoce da terapia antifúngica diminuindo a mortalidade relacionada à infecção fúngica, e o tempo de internação dos pacientes em unidades de saúde. Este estudo tem como objetivo o desenvolvimento e avaliação de teste molecular para a detecção de infecção fúngica em pacientes imunocomprometidos através de PCR do tipo multiplex utilizando a sequência ITS como alvo, e sequências de rDNA específicas para detecção de 6 espécie de fungos de importância para a saúde humana: A. fumigatus, C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. neoformans. Dos 84 pacientes analisados, 46 foram adultos em tratamento oncológico e 38 neonatos. Das 144 amostras de sangue submetidas a PCR convencional com os iniciadores para a detecção da região ITS, 84 foram positivas e 60 negativas. As amostras positivas foram submetidas a PCR multiplex para a determinação da espécie do fungo. 46 foram positivas para uma ou mais espécie fúngica, sendo as espécies mais encontradas a C. parapsilosis (23,8%), C. glabrata (19,0%), C. neoformans (14,2%), C. tropicalis e C. albicans (ambas 4,7% dos casos). A baixa frequência de C. albicans possivelmente está relacionada ao uso profilático do antifúngico fluconazol. A PCR convencional apresentou sensibilidade de 67,3% (53,2-79,0), especificidade de 47,2% (36,6-58,0), valor preditivo positivo de 44,0% (33,4-55,3) e valor preditivo negativo de 70,0% (56,6-80,8) em relação ao diagnóstico da doença, baseado na clínica, comprovação microbiológica e teste terapêutico. As curvas melting da PCR em tempo real utilizando o sistema de detecção SYBR Green obtidas pela amplificação da sequência subclonada de rDNA de cada espécie em plasmídeo apresentaram formato alargado, possivelmente devido a homologia entre o iniciador e diferentes regiões das sequências de rDNA das espécies de fungos estudadas, principalmente nas espécies de Candida, permitindo a amplificação inespecífica em diferentes temperaturas de anelamento avaliadas. As curvas de amplificação das sequências subclonadas de rDNA de cada espécie utilizando o sistema TaqMan apresentaram reprodutibilidade, e especificidade nos experimentos utilizando o par de iniciador e sonda especifico para uma dada espécie com sequências de rDNA clonadas das demais espécies de fungos analisadas, executando o teste para C. neoformans, mostrando o potencial do teste para utilização em amostras clínicas.