Purificação e caracterização de proteases fibrinolíticas produzidas por Mucor subtilissimus UCP 1262 para possível aplicação na terapia trombolítica

Abstract

A utilização de enzimas proteolíticas em aplicações terapêuticas tem sido um dos objetivos da indústria farmacêutica nos últimos anos. Entre as várias proteases utilizadas em terapias, destacam-se as proteases fibrinolíticas, que são enzimas capazes de degradar à fibrina, principal componente do coágulo sanguíneo. Há uma crescente busca por metodologias eficazes e de baixo custo para a purificação dessas enzimas, uma vez que qualquer fármaco necessita de um alto grau de pureza e especificidade para evitar reações imunológicas. Nesse sentido, o objetivo desse trabalho foi purificar proteases fibrinolíticas produzidas por Mucor Subtilissimus UCP 1262 através de sistema de duas fases aquosas e métodos cromatográficos, além de caracterizá-las bioquímica e estruturalmente. Um planejamento fatorial completo do tipo 2 ³ e a metodologia de superfície de resposta foram usados para identificar as condições ótimas para a extração de uma protease fibrinolítica por sistema de duas fases aquosas, enquanto métodos cromatográficos tradicionais foram utilizados para purificar outra protease fibrinolítica. A primeira enzima foi recuperada e purificada parcialmente por sistemas de duas fases aquosas constituídos por polietilenoglicol (PEG) e sulfato de sódio, onde a melhor condição a do sistema formado por 30,0% (m/m) de PEG 6000g/mol e 13,2% (m/m) de sulfato de sódio, que assegurou um fator de purificação de 10,um coeficiente de partição de 0,2 e uma recuperação de 102,0%. A SDS-PAGE e o zimograma de fibrina revelaram que essa protease fibrinolítica purificada tem uma massa molecular de 97 kDa e um ponto isoelétrico de 5,4 e é uma serino protease semelhante a quimotripsina. A temperatura ótima da enzima foi de 37ºC e sua atividade foi estável por 150 minutos. A outra protease fibrinolítica foi pré-purificada inicialmente através de precipitação com sulfato de amônio (40 – 60% de saturação) e posteriormente através de cromatografia de troca iônica (DEAE-Sephadex A50) e gel filtração (Superdex 75 HR10/300) e igualmente caracterizada como serino protease do tipo quimiotripsina, com uma massa molecular de 20 kDa, um ponto isoelétrico de 4,94,e temperatura e pH ótimos de 40°C e 8,0 respectivamente. Sua atividade proteásica foi aumentada na presença de Cu²⁺, Mg²⁺ e Fe²⁺ e sua estrutura secundária mostrou alta composição de α-hélice e nenhuma mudança significativa após exposição à presença de polímeros ou da maioria de agentes desnaturantes. Este estudo demonstra a possibilidade de purificar proteases fibrinolíticas com baixo custo e de considerá-las como potenciais candidatos a agentes trombolíticos.