Purificação e caracterização de enzimas fibrinolíticas obtidas de Arthrospira platensis

Abstract

Uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo são as doenças cardiovasculares (DCV) que estão intimamente associadas com a formação desordenada de coágulos sanguíneos. A terapia fibrinolítica é um tratamento padrão para estas desordens, entretanto as enzimas fibrinolíticas atualmente utilizadas possuem efeitos colaterais indesejáveis. Neste sentido, a busca por novas enzimas fibrinolíticas mais seguras e com menos efeitos colaterais têm recebido atenção. Estudos demonstraram a utilização de microrganismos fotossintetizantes para produção de enzimas fibrinolíticas. Estes microrganismos são importantes fontes de substâncias ativas para o tratamento de várias doenças, incluindo Arthrospira platensis que têm sido amplamente utilizada na aplicação de cosméticos e produtos farmacêuticos. À vista disso, este trabalho teve como finalidade purificar e caracterizar proteases fibrinolíticas produzidas pela cianobactéria, Arthrospira platensis. O microrganismo foi cultivado em meio Schlösser sem nitrato de sódio (NaNO3) e suplementado com 0,2% de milhocina com uma concentração celular inicial de 50 mg/L, 30 ± 2 ºC e 45 ± 5 μmol de fótons m⁻²s⁻¹. A extração da enzima fibrinolítica foi realizada por homogeneização de 50 mg/mL da biomassa liofilizada em tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, durante 30 minutos à temperatura ambiente (30 ± 2 °C). A proteína foi precipitada utilizando 70% (m/v) de sulfato de amônio e purificada utilizando dois passos cromatográficos, cromatografia de troca iônica (DEAE-Shephadex) e gel filtração (Superdex 75). A enzima purificada foi então utilizada para avaliação da sua massa molecular por métodos eletroforéticos, caracterização bioquímica quanto a temperatura e ao pH ótimos, estabilidade enzimática à temperatura e ao pH, avaliação do efeito de íons e surfactantes na atividade fibrinolítca e classificação quanto ao tipo de enzima proteolítica. A enzima fibrinolítica purificada apresentou aumento de 32,72 vezes no fator de purificação e recuperação de 28,85% em relação às proteínas do extrato bruto inicial, além de massa molar equivalente a 72,6 kDa e atividade fibrinolítica específica de 7988,34 U/mg. Esta exibiu uma temperatura ótima de 40 ºC e foi estável nesta temperatura por 150 minutos e pH ótimo de 6,0, e maior estabilidade no pH 7,0, no qual manteve sua atividade por 24 horas. A enzima mostrou aumento da atividade específica na presença de íons (Fe²⁺, Zn²⁺ K⁺) e surfactantes (Triton X-100), tendo a atividade enzimática completamente inibida na presença de PMSF, indicando ser uma serino protease. O zimograma utilizando fibrina como substrato específico evidenciou que a enzima fibrinolítica estudada atua de forma semelhante a plasmina, apresentando especificidade pela fibrina. Portanto, esta enzima fibrinolítica (72,6 kDa) representa um possível agente terapêutico para utilização no tratamento de doenças trombolíticas como infarto do miocárdio, doenças cardíacas isquêmicas, trombose venosa profunda e tromboembolismo venoso.