Avaliação funcional de polimorfismos do oncogene E6 do Papilomavírus humano 31

Abstract

Existem cerca de 200 tipos de HPV, dos quais 40 acometem o trato genital, e 15 deles são considerados de alto risco oncogênico, dentre eles, o HPV-31, que é inclusive, o segundo mais frequente em Pernambuco. As oncoproteínas E6 e E7 são responsáveis pela atividade transformante dos HPVs de alto risco. Através de estudos epidemiológicos foi estabelecida a relação entre os tipos de HPV e câncer cervical. Este estudo teve como objetivo, checar o efeito das variantes no oncogene E6 do HPV-31 presentes em Pernambuco (Nordeste, Brasil), inferindo a importância clínica com relação à oncogenicidade do câncer de colo uterino. Os polimorfismos estudados para E6 HPV-31 foram identificados pelo nosso grupo de pesquisa. As amostras foram sub-clonadas em vetor pCI neo para expressão em células de mamíferos. As amostras clonadas foram sequenciadas e alinhadas com a sequência de referência do HPV-31. As construções apresentando os vetores recombinantes contendo E6 foram utilizadas para transfecção de células HEK293. Para investigar os efeitos dos polimorfismos presentes em E6 na via NF-κB, as células foram transfectadas com o vetor de expressão contendo as variantes H60Y, T64A, K123R, A138V, R144G e o Full (amostra apresentando todas as variantes), com o plasmídeo repórter de luminescência (κB) 3-Luc e com o plasmídeo normalizador de luminescência pRenilla, e com o protótipo de E6 do HPV-31(sequência sem nenhum polimorfismo). Para avaliar os efeitos obtidos, nossas construções foram comparadas com a sequência protótipo, e o vetor vazio que foi usado como controle positivo da ativação da via. Após a transfecção as células foram lisadas, os extratos celulares foram preparados para leitura da luciferase de firefly e renilla as quais determinaram o fold da via NF-κB. Foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre E6 R144G. Porém para a variante T64A houve uma regulação negativa significante na atividade da via, também em conjunto, os polimorfismos apresentaram uma diminuição na atividade de NF-kB. Para a análise da atividade transcricional de E6, a variante R144G, apresentou uma expressão muito baixa de RNAm. Enquanto a variante T64A apresentou níveis aumentados de expressão relativa. Este estudo corrobora com dados já existentes na literatura sobre os polimorfismos. Além de contribuir para expansão do conhecimento acerca de alterações nucleotídicas no oncogene E6 e seu papel na imortalização celular.