Análise comparativa da atividade leishmanicida in vitro do ácido úsnico e do seu derivado usnato de potássio isolado da Cladonia substellata Vainio

Abstract

A leishmaniose apresenta-se como um grave problema de saúde pública em muitos países do mundo, afetando populações social e economicamente vulneráveis. A busca por novos fitoquímicos com ação antiparasitária, menor toxicidade e de baixo custo surge como uma alternativa aos tratamentos existentes. Alguns estudos mostraram que o ácido úsnico (AU) possui diversas atividades biológicas (antiproliferativa, antiviral, anti-inflamatória, antimicrobial e antiparasitária), no entanto apresenta elevada hepatotoxicidade e baixa solubilidade. A forma solúvel do AU, sal de potássio derivado do ácido úsnico (PS-UA) ou usnato de potássio, tem sido utilizada por alguns pesquisadores no intuito de aumentar sua eficácia e reduzir sua toxicidade. No presente estudo, objetivou-se analisar a atividade leishmanicida in vitro do AU e do PS-UA frente às formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi e a citotoxicidade em macrófagos (RAW 264.7); assim como, avaliar se esses compostos interferem na morfologia do parasita. O AU foi isolado do extrato bruto do líquen Cladonia substellata Vainio e o PS-UA foi obtido a partir da salinização desse extrato. A atividade antiprotozoária do AU e do PS-UA contra formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi e a viabilidade celular foram avaliadas pelo ensaio do MTT. Análises estruturais e ultraestruturais dos parasitos foram realizadas através de microscopia eletrônica. Adicionalmente, neste estudo foi utilizada a técnica de eletroforese em gel bidimensional (2D) e espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF) com a finalidade de destacar e identificar proteínas diferencialmente acumuladas nas formas promastigotas dos parasitas sob ação do PS-UA (6,25 μg/mL). A IC50 do AU e do PS-UA frente às formas promastigotas de L. (L.) infantum chagasi foram determinadas (18,30 ± 2,00 e 3,71 ± 2,99 μg/mL, respectivamente) e a concentração da IC₅₀ do PS-UA revelou ser sete vezes menos tóxica para os macrófagos (CC₅₀ = 26.31 ± 13.55 μg/mL, IS = 7). A análise dos parasitas pela microscopia eletrônica de varredura revelou alterações de superfície e de forma (conforme as concentrações de IC₅₀ determinadas). Foram observadas as seguintes alterações ultraestruturais: sob ação do AU detectou-se tumefação dos parasitas, perda de polaridade celular e aumento do número de vacúolos citoplasmáticos; já sob ação do PS-UA observou-se modificações na cromatina nuclear, intensa vacuolização citoplasmática, extensa tumefação mitocondrial, corpos lipídicos e vesículas elétron-densas por todo o citoplasma. Através da eletroforese (2D) foi observado um total de 450 spots proteicos e na análise comparativa dos perfis proteômicos entre as formas promastigotas tratadas com PS-UA e as formas não tratadas foram revelados 173 spots, sendo 81 spots encontrados exclusivamente no perfil proteico das formas não tratadas e 63 spots nas formas tratadas, com um acúmulo diferencial de 29 spots. Dentre as proteínas diferencialmente acumuladas, o Fator de Iniciação Traducional (IF-2), importante na síntese proteica, apresentou-se reduzido sob efeito do PS-UA. Na ontologia gênica para regulação de processos biológicos, verificou-se que o PS-UA exerceu considerável influência com relação à expressão de proteínas. O PS-UA foi eficaz contra as formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi sem causar toxicidade às células de mamíferos, destacando-se como uma nova proposta de fármacos leishmanicidas.