Avaliação de imunoensaios para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar utilizando peptídeos e proteínas preditas in silico

Abstract

A Leishmaniose Tegumentar (LT) é uma doença reemergente e negligenciada que representa um grave problema de saúde pública mundial. Nas Américas, o Brasil apresenta a maior prevalência de casos, onde Pernambuco é um dos estados endêmicos para a doença. Considera-se que para o controle efetivo é necessário diagnosticar os casos precocemente e tratá-los, além de controlar vetores e aplicar vacinas; porém, isto ainda não é uma realidade. Um ponto crucial dentro dessas limitações é a ausência de um método padrão-ouro para o diagnóstico, e os utilizados variam na precisão dos resultados. Nesse cenário, uma possível solução é a expansão das aplicações das ferramentas de bioinformática, utilizadas como valiosas estratégias para a obtenção de antígenos específicos de agentes infecciosos com o intuito de aprimorar o desempenho dos métodos existentes. Em trabalhos anteriores, nosso grupo fez uso de ferramentas in silico e obtendo-se duas proteínas recombinantes (1140 e 0750) com potencial de diagnóstico; dez sequências peptídicas (organizadas nos pools P1 e P2); e duas proteínas quiméricas com potencial vacinal. Assim, o objetivo do presente trabalho foi otimizar metodologias sorológicas convencionais, incorporando o uso das moléculas obtidas in silico, descritas anteriormente. Para tal, amostras de soro de pacientes portadores de LT ativa (N=30), Leishmaniose Visceral (LV) (N=30 e Psoríase (PSO) (N=22), bem como amostras de indivíduos saudáveis (N=10), foram utilizadas nos testes. Proteínas e peptídeos foram avaliados nos ensaios do teste de ELISA e Citometria de Fluxo (CF). Como primeiro resultado dos ensaios de CF, o acoplamento das proteínas (0750,1140 e PADRE), individualmente, com esferas de poliestireno foi obtido com êxito, avaliado através do controle do acoplamento e controle do conjugado. Entretanto, quando as moléculas foram testadas com amostras de pacientes de LT ativa e controles saudáveis, não foi possível diferenciar ambos os grupos. Os testes de ELISA foram realizados com cada umas das moléculas com o intuito de avaliar o desempenho na identificação de portadores de LT e no diagnóstico diferencial com LV e PSO. Dos resultados obtidos com as proteínas recombinantes, a proteína 1140 apresentou a melhor sensibilidade (90%) para detecção de portadores de LT. Esta proteína é derivada de regiões com maior número de epítopos específicos de célula B no proteoma de L. (V.) braziliensis. Em relação aos dois pools de peptídeos, o P1 demonstrou a melhor sensibilidade quando comparado ao P2. Este resultado pode ser baseado no fato de que os peptídeos que compõem o P2 foram descritos anteriormente por apresentar um perfil de resposta inespecífico, onde estimularam células de pacientes de LT e controle. Em relação aos níveis de reações cruzadas com LV e PSO, um resultado interessante foi observado com a 0750 (86,67%), que apresentou um maior índice de especificidade para LT, em comparação com a 1140 (50%). Essas proteínas são provenientes de regiões conservadas entre as espécies de L. (V.) braziliensis e L. infantum, explicando a possibilidade de reação com as amostras de LV da 1140. O mesmo fato pode explicar a presença de reatividade de ambos os pools com as amostras de LV; porém, também foi observada reatividade com as amostras de PSO. Pacientes portadores dessa doença apresentam um quadro de inflamação com resposta celular intensa, possibilitando a ligação inespecífica dessas células com os anticorpos gerando resultados falso-positivos. Por fim, de acordo com os resultados obtidos, a proteína recombinante 1140 e o pool de peptídeos P1 demonstraram resultados promissores para um diagnóstico sorológico eficaz da LT.