Pontos quânticos conjugados as lectinas das folhas de Schinus terebinthifolius (SteLL) e sarcotesta de Punica granatum (PgTeL) como potenciais nanoferramentas fluorescentes para estudos glicobiológico

Abstract

Lectinas são proteínas capazes de reconhecer e se ligar de forma específica, porém reversível, a monossacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos e ainda glicoconjugados. Uma vez conjugadas a fluoróforos, podem constituir sondas interessantes para estudos glicobiológicos. Este trabalho descreve o desenvolvimento de dois novos nanoconjugados baseados em pontos quânticos (quantum dots, QDs) carboxilados conjugados à lectina das folha de Schinus terebinthifolia (SteLL) ou à lectina da sarcotesta de Punica granatum (PgTeL). Devido a sua complexa glicocomposição, células de Cryptococcus neoformans foram escolhidas para avaliar a eficiência dos nanoconjugados. Inicialmente, as lectinas foram purificadas e tiveram seus pontos isoelétricos (pI) determinados. As conjugações ocorreram via adsorção em diferentes valores de pH e os parâmetros ópticos (emissão e absorção), fluorescência relativa (FR) e atividade hemaglutinante (AH) foram analisados. A estabilidade das lectinas nos conjugados frente a agentes desnaturantes foi investigada por meio de fluorimetria. Por fim, as marcações de C. neoformans foram quantificadas por citometria de fluxo e observadas por meio de microscopia de fluorescência. SteLL apresentou pI de 5,7 e PgTeL 6,5. Os conjugados QDs-SteLL e QDs-PgTeL obtidos em pH 7,0 e 8,0, respectivamente, mostraram ausência de precipitados e permaneceram funcionais (testados através da atividade hemaglutinante) no período de pelo menos 9 meses, amplo espectro de absorção e estreito de emissão, além de uma intensa fluorescência. A FR confirmou a conjugação e o ensaio de AH indicou que a capacidade de ligação a carboidrato das lectinas foi preservada após a conjugação. Quando conjugadas, SteLL e PgTeL mostraram estabilidade frente a altas concentrações de ureia e aquecimento. Foi possível observar marcações acima de 90% das células de C. neoformans por citometria de fluxo, o que foi confirmado por microscopia de fluorescência. A marcação de C. neoformans por conjugados foi inibida por glicoproteínas (fetuína, ovalbumina e azocaseína), sugerindo interações específicas através do sítio de ligação de carboidratos das lectinas. Em conclusão, um protocolo eficaz para a conjugação de SteLL ou PgTeL com QDs foi desenvolvido, resultando em duas novas nanossondas úteis para estudos glicobiológicos.