Purificação de colagenase utilizando compósito magnético de Azocoll e sua caracterização

Abstract

Colagenase (EC 3.4.24.3), enzima proteolítica capaz de degradar a tríplice hélice do colágeno, foi purificada, neste trabalho em uma etapa mediante o emprego de um compósito magnético contendo o ligante azocoll, colágeno impregnado com azocorante, amplamente utilizada como substrato específico para colagenases. A colagenase purificada utilizando o compósito MPs-Azocoll apresentou purificação de 16,6 vezes e rendimento de 33,1%. O peso molecular da colagenase purificada de O. mossambicus foi estimado em 30 kDa, corroborando valores de colagenase de peixe relatados na literatura. O reuso da MPs-Azocoll apresentou purificações de 15,9-14,9 vezes, com rendimentos entre 33-31%. Os resultados de caracterização da MPs-Azocoll sugerem a presença do azocoll nas partículas, observado pelos picos característicos do colágeno na Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR); através do deslocamento angular na Difração de Raio-X (DRX) e na presença do carbono na análise elementar pela Espectroscopia de Raio-X por dispersão em energia (EDX). Foi utilizado o planejamento fatorial com análise estatística de variância (ANOVA) para aperfeiçoamento do processo de purificação com MPs-Azocoll. Os parâmetros analisados foram: (A) quantidade de partícula magnética usada na purificação; (B) quantidade de azocoll usado na síntese da partícula; (C) volume de extrato bruto; e (D) tempo de incubação. O modelo estatístico foi significativo de acordo com os valores de p e F. As variáveis estatisticamente significativas foram: (B) quantidade de azocoll usado na síntese da partícula e (D) tempo de incubação. A MPs-Azocoll otimizada foi testada na purificação de collagenase de outras fontes utilizando extratos brutos de vísceras do peixe (Scomber japonicus) e caldo de cultivo fúngico (Penicillium sp.) obtendo resultados de purificação (20; 22,2 vezes e rendimento de 35,8; 94,5% respectivamente) superiores aos testados anteriormente. A colagenase caracterizada de S. japonicus foi determinada como uma serino-protease, alcalina, com melhor atividade no pH 8,0, e a 50°C. Estas características garantem a possibilidade de aplicação da colagenase. Estes resultados demonstram que a partícula magnética contendo azocoll pode ser aplicada na purificação de colagenase em um processo de etapa única, empregando compósito de fácil síntese, baixo custo e reutilizável.