Identificação de Fatores Moleculares Potencialmente Associados com a Infecção de Linhagens de Células de Inseto pelo Vírus Zika

Abstract

O ressurgimento das arboviroses constitui uma ameaça contínua para a saúde pública devido a altas taxas de disseminação e expansão geográfica dos seus mosquitos vetores, o que resulta em complicações clínicas e impactos na economia global. O status de transmissão do ZIKV é uma preocupação de interesse internacional dado ao seu potencial de ressurgir como uma epidemia. A falta de esclarecimentos sobre a biologia da interação vírus-vetor nos levou a investigar as bases moleculares in vitro da interação ZIKV-receptor. Assim, o presente estudo teve como objetivo identificar potenciais ligantes da proteína do envelope recombinante do ZIKV a partir de extratos proteicos das linhagens celulares C6/36 (Aedes albopictus) suscetível ao ZIKV e Sf9 (Spodoptera frugiperda) não suscetível a vários Flavivírus, através de ensaios de ligação proteína-proteína seguidos de espectrometria de massas e análises in silico. Para a execução, extratos de proteínas de membrana celular foram obtidas pelo kit Mem-PER Plus Membrane Protein Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) e avaliadas qualitativamente e quantitativamente, seguidas de ensaios de interação do tipo pull-down. A proteína do envelope (E) recombinante do ZIKV (ENV-GST) produzida, purificada e dialisada foi quantificada por curva de BSA e imunodetectada por western-blotting com anticorpo comercial “Mouse Anti-Flavivirus Envelope Protein Antibody 4G2”. No ensaio de ligação proteína-proteína, a ENV-GST imobilizada em resina de glutathione sepharose® 4B (GE Healthcare) foi incubada individualmente com os extratos de proteínas de membrana de cada linhagem celular em réplicas biológicas. As proteínas coprecipitadas ligantes da ENV-GST, passaram por migração eletroforética em SDS-PAGE e excisadas para análise em cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS) no sistema Orbitrap Exploris 120. Além disso, os resultados de SDS-PAGE e western-blotting evidenciaram a integridade das amostras proteicas extraídas e especificidade do ensaio de ligação de pull-down em captar proteínas ligantes da ENV-GST. A espectrometria de massas identificou 165 proteínas totais, estas, após filtragem e normalização, resultaram em 9 proteínas ligantes das amostras de C6/36 e 11 para Sf9. Alguns ligantes candidatos evidenciados em Sf9 foram Glutathione Transferase, Heat shock 70 kDa protein cognate 5 e Prostaglandin reductase 1, para C6/36 Arginine- tRNA ligase, Heat shock 70 kDa protein cognate 5 sendo a ADP/ATP translocase identificada em ambas as células C6/36 e Sf9. Análises in silico foram conduzidas através da predição das estruturas das proteínas ligantes pelo AlphaFold2 seguidas de análises de docking molecular, onde pudemos validar a afinidade de ligação de alguns ligantes à proteína E do ZIKV. Em conclusão, conseguimos identificar algumas moléculas candidatas a ligantes com potencial participação durante o ciclo viral de interação com as células de inseto.