Desenvolvimento e validação de sistemas baseados em Lamp (amplificação isotérmica em alça) e PCR convencional para o diagnóstico da Wuchereria bancrofti em fluidos biológicos

Abstract

A filariose linfática é uma parasitose, que há 17 anos, vem ocupando o segundo lugar no ranking mundial das doenças incapacitantes. O Plano Global de Eliminação da Filariose Linfática (PGEFL) tem como meta eliminar esta parasitose até o ano de 2020, e um dos pilares é o desenvolvimento de novos métodos diagnósticos. A proposta do presente estudo é desenvolver e validar sistemas baseados em LAMP e PCR convencional para o diagnóstico da FB em fluidos biológicos. Dos resultados obtidos durante a otimização da PCR convencional, foi obtido um limite de detecção de 0,1fg. Além disso a PCR convencional foi aplicada em fluidos biológicos com sucesso, sendo utilizada em 20 amostras pareadas de sangue, soro e urina. Também foi otimizada a reação de LAMP que teve como limite de detecção 1 fg e amplificação apenas do DNA da Wb diante dos outros parasitas endêmicos estudados. A LAMP também foi testada em 30 amostras coletadas no período diurno, tendo 29 amostras positivas e uma amostra negativa para OG4C3, ELISA e LAMP. Em relação a validação das técnicas, PCR e LAMP foram testadas frente a 190 amostras de soro, sendo 95 positivas e 95 negativas pelo método de ICT e FMP. A sensibilidade e especificidade do ensaio LAMP foi de 100 % para ambos os testes; para PCR, os valores foram de 97.8 % e 98.9 %, respectivamente. O ensaio LAMP apresentou o VPP e VPN de 100% mais alto que a PCR [VPP (98.9%) e VPN (97.9%)]. A técnica de PCR obteve uma acurácia de 98,4% comparada com a de 100% do LAMP. O diagnóstico é um dos pilares para o controle da bancroftose, no entanto, os ensaios de diagnóstico atualmente disponíveis não são ideais. O nosso trabalho demonstrou a possibilidade da utilização das técnicas de LAMP e PCR quando comparados os métodos, ao contrário da PCR, o ensaio LAMP não requer ciclos de amplificação por termociclagem ou utilização da eletroforese para se visualizar os resultados; seu uso no campo, portanto, é facilitado. Desta forma, as técnicas de LAMP e PCR demonstraram rapidez, simplicidade, sensibilidade e especificidade adequada para a detecção de DNA. LAMP se mostrou, ainda, de fácil aplicação, o que pode melhorar a identificação de casos com infecções de baixa intensidade e tratamento direcionado, sendo de grande importância para o controle da FB e seu programa de eliminação.